在流式细胞术实验中，将实体组织制备成单细胞悬液是一个关键步骤。这一过程包括组织切割、酶促消化和机械分离，目的是在消化基质成分和裂解细胞-细胞连接的同时，保持细胞活性和相关抗原的存在，分离出单个细胞，以获得高质量的流式细胞术数据。
1、增加组织表面积
为了最大化组织与消化酶的接触，首先需要将固体组织材料的表面积增加，这通常通过切碎或分散组织来实现。
2、酶消化
组织中的细胞通过细胞外基质和细胞-细胞连接在一起，这些由多种蛋白质和其他生物分子组成，需要特定的酶来进行适当的消化和去除。
主要酶类及其用途：
•分散酶（Dispase）：一种中性蛋白酶，特异性高，主要作用于IV型胶原和纤维连接蛋白，有助于细胞的分离和组织块的解离，但使用时需注意，它可能会裂解特定的表面分子或抗原。•胶原酶（Collagenase）：能够断裂胶原中的肽键，帮助消化细胞外基质，释放细胞。•透明质酸酶（Hyaluronidase）：降解细胞外基质中的透明质酸。•木瓜蛋白酶（Papain）：降解紧密连接的蛋白质，但可能导致细胞裂解和DNA释放，从而引起细胞粘连。•脱氧核糖核酸酶（DNase-I）：降解游离DNA，防止细胞粘连，而不影响细胞凋亡途径。
消化的时候，需注意以下几点：
•酶的最佳浓度和强度：过高的浓度可能会影响细胞表面标志物，从而影响这些标志物的可用性以及细胞在后续实验中的活性。因此，对于粘附能力不强的细胞，如淋巴细胞，应使用较短的消化时间和温和或轻微的酶来避免这些问题。•消化时间：消化时间是一个关键因素，需要根据所用的特定酶和组织来确定。不足的消化（under digestion）会导致细胞粘连和细胞碎片的增加，而过度的消化（over digestion）会导致细胞活性显著下降以及细胞碎片和粘连体的增加。•消化温度：酶消化通常在特定温度下进行，以确保酶的最大速度和效率，通常为37°C。较低的温度，如4°C或冰上，可能会减慢酶的反应速率并延长孵化时间，但有助于最小化细胞死亡。•对表面抗原的影响：如果评估的是细胞表面蛋白，应避免使用胰蛋白酶（trypsin），因为它可能会裂解细胞表面受体或膜蛋白，导致免疫表型实验中出现假阴性结果。
3、机械分离
在酶促消化过程中，通过轨道摇床等工具协助机械分离，帮助细胞从细胞外基质中释放出来。
4、评估单细胞悬液
在进行流式细胞术实验之前，评估单细胞悬液至关重要，需要检查细胞活性、无大量细胞碎片和无大量粘连体。
5、活性提高和细胞碎片去除
必要时，可使用Miltenyi Biotec或STEMCELL Technologies的dead cell removal kit通过磁珠分离技术去除细胞碎片和死亡细胞，以提高样本的纯度。
6、单细胞悬液的冷冻保存
冷冻保存的单细胞悬液应尽快用于流式细胞术实验，或在冷冻保存前进行温和固定，以避免在冷冻过程中改变抗原的表达或存在。
在制备单细胞悬液的过程中，还需要注意以下几点：
•避免使用组织匀浆器：这种强力的机械分离方法会破坏细胞的完整性，不适合制备单细胞悬液。•温和处理细胞：避免剧烈的漩涡处理，以保持细胞的活性和完整性。•正确的离心力：根据细胞类型和状态，选择合适的相对离心力（RCF），避免过高或过低的离心力导致细胞损伤或丢失。
参考文献：Reichard A, Asosingh K. Best Practices for Preparing a Single Cell Suspension from Solid Tissues for Flow Cytometry. Cytometry Part A. 2019;95A:219-226. doi:10.1002/cyto.a.23690.
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